Gram-kleuring

De blauwpaarse kleur van Gram-positieve Staphylococcus aureus bacteriën, 1000 keer vergroot

Gram-kleuring is een methode om bacteriën te kleuren om ze onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken en als hulpmiddel bij het herkennen van soorten.

De methode is genoemd naar de uitvinder ervan, de Deense microbioloog Hans Christian Gram (1853-1938), die de techniek in 1884 ontwikkelde voor het onderscheiden van pneumokokken (Streptococcus pneumoniae) van Klebsiella pneumoniae. De kleuring wordt daarom ook altijd aangeduid met een hoofdletter: Gram-kleuring.

Met behulp van deze methode gekleurd, vallen bacteriën namelijk uiteen in twee verschillend aankleurende groepen, die men Gram-negatief (rood) of Gram-positief (blauwpaars) noemt.

Werking

De bacteriën worden eerst gekleurd met een kristalviolet-jodium complex, daarna ontkleurd met alcohol en vervolgens nagekleurd met waterige fuchsine. Bij Gram-positieve bacteriën wordt het kristalviolet-jodium complex niet weggewassen door de alcohol; deze cellen kleuren blauw-paars. Gram-negatieve cellen verliezen de eerste kleurstof weer door het alcoholbad; door de nakleuring met fuchsine kleuren ze daarna rood. Van belang is wel, dat voor de Gram-kleuring enkel bacteriën worden gebruikt uit een 24 uur oude cultuur, omdat in oudere culturen Gram-variabiliteit kan optreden.

Verklaring

Het verschil tussen Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën wordt veroorzaakt door een verschil in de structuur van de celwand:

• Gram-positieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag welke ondoordringbaar is voor het alcoholmengsel, waardoor deze niet worden ontkleurd.
• Gram-negatieve cellen hebben buiten het cytoplasmamembraan een heel dunne peptidoglycaanlaag.

Bouw van een Gram-negatieve celwand

Buiten de dunne laag peptidoglycaan zit nog een tweede membraan. Dat buitenmembraan bevat lipopolysacchariden (kortweg LPS), die de cel een extra bescherming bieden. Dit lipopolysacharidemembraan is op te delen in 2 soorten:

• het kernlipopolysacharidemembraan
• het O-lipopolysacharidemembraan

Het kernlipopolysacharidemembraan zit dichter op de bacterie terwijl het O-lipopolysacharidemembraan de buitenste buitenkant is van elke Gram-negatieve bacterie. De celwand van Gram-negatieve bacteriën verliest het kristal-violet van de eerste kleuring bij het spoelen met alcohol weer en kleuren rood; terwijl de Grampositieve de paars-blauwe kleur vasthouden, omdat hun celwand het kristalviolet wel permanent absorbeert ten gevolge van een bindingsreactie met de lugol.

Uitvoering

• Markeer de bovenkant van een voorwerpglaasje met een krasstaafje
• Breng op een voorwerpglas met behulp van een entoog een druppel fysiologisch zout (0,9% NaCl) en strijk deze uit (fysiologisch zout is alleen nodig in geval van een 'vaste bacterie-cultuur').
• Suspendeer een zeer geringe hoeveelheid bacteriemateriaal in de druppel en strijk deze uit over het glas (over een oppervlak van ongeveer een euro).
• Laat drogen aan de lucht (of hoog boven de vlam).
• Fixeer door driemaal kort door de vlam te halen en laat afkoelen.
• Kleur het preparaat minstens 1 minuut met kristalvioletoplossing en spoel daarna voorzichtig met water
• Behandel met lugol (een oplossing van jodium in een kaliumjodideoplossing), 1 minuut.
• Giet de lugol af (niet spoelen) en ontkleur 20 seconden met 96% alcohol en spoel met water na.
• Kleur 1 minuut na met waterige fuchsine
• Spoel goed met water, vloei voorzichtig af tussen filtreerpapier en laat het preparaat drogen aan de lucht. Het kan dan onder de microscoop met olie-immersie worden bekeken (geen dekglaasje!).

Klinische belang

Het maakt voor het beloop van de ziekte en de keuze van de behandeling verschil of de infectie door een Gram-positieve of een gram-negatieve bacterie veroorzaakt wordt. Over het algemeen treedt penicillineresistentie (ongevoeligheid) bij Gram-positieve bacteriën minder op dan bij Gram negatieve, tenzij ze het enzym beta-lactamase kunnen produceren. Bij resistentie liggen een lactamase resistent smal spectrum penicilline, zoals flucloxacilline, of toevoeging van de lactamaseremmer clavulaanzuur meer voor de hand dan breed-spectrum penicillines zoals amoxicilline. Gram-negatieve bacteriën zorgen met hun LPS-laag dat het menselijk immuunsysteem daar sterk op reageert; de dode bacteriën zijn zelf een endotoxine, waar je ziek van kunt worden. Een exotoxine is een gifstof die een -meestal Gram-positieve- bacterie (zoals de difterie- of de tetanusbacterie of ook Stafylococcus aureus produceert.

Voorbeelden

Enkele voorbeelden van Gram-positieve (Gram+) bacteriën zijn:

• Streptokokken (o.a. veroorzakers van tandbederf)
• Lactococcus lactis (toegepast bij kaasbereiding)
• Lactobacillus acidophilus (toegepast in gefermenteerde zuivelproducten)
• Lactobacillus casei (toegepast in gefermenteerde zuivelproducten)
• Bacillus anthracis (miltvuur-bacterie)
• Stafylokokken

Enkele voorbeelden van Gram-negatieve (Gram-) bacteriën zijn:

• Salmonella (sommige soorten zijn onschadelijk, andere kunnen voedselvergiftiging of buiktyfus veroorzaken)
• Campylobacter
• Meningokok (kan hersenvliesontsteking (meningitis) veroorzaken)
• Neisseria gonorrhoeae (kan de geslachtsziekte gonorroe veroorzaken)
• Pseudomonas aeruginosa (komt voor als ziekenhuisbacterie)
• Chlamydia trachomatis (veroorzaakt chlamydiasis)

Jonge culturen van Clostridium zijn meestal Gram-positief, oudere meestal Gram-negatief.

In de volgende tabel enkele Gram-positieve en -negatieve bacteriën die in een direct preparaat zichtbaar kuunnen zijn:

ziekteverwekker onder microscoop	gevonden in	ziekte	bacteriesoorten	antibiotica
Gramnegatieve kokken	urethrale uitvloed of vaginale afscheiding	gonorroe	gonokokken	penicilline eventueel met clavulaanzuur
Gramnegatieve kokken	liquor (ruggenprik)	hersenvliesontsteking	meningokokken	penicilline
Grampositieve kokken in rijtjes of tweetallen	sputum, pus	longontsteking; wondinfectie;	Streptokokkensoorten	penicilline
Grampositieve kokken in groepjes	pus	wondinfecties, huidinfecties, botinfectie	Stafylococcus aureus;	flucloxacilline, penicilline met clavulaanzuur
Gramnegatieve staafjes	urine; sputum	urineweginfectie; luchtweginfectie	Vele; onder meer E. Coli; Enterobacteriaceae; Proteus; Klebsiella; Haemophilus influenzae; Pseudomonas aeruginosa	Amoxicilline, andere breedspectrumantibiotica
Grampositieve staafjes	ascitesvocht; gangreen	Listeriose; gasgangreen	Listeria monocytogenes, Bacterioides	Penicilline, vanwege de ernst vaak met een aminoglycoside

Zie ook

• Endotoxine
• Ziehl-Neelsen-kleuring