Gramkleuring

Uit Wikipedia, de vrije encyclopedie
Ga naar: navigatie, zoeken
De blauwpaarse kleur van grampositieve Staphylococcus aureus bacteriën, 1000 keer vergroot

Gramkleuring is een methode om bacteriën te kleuren om ze onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken en als hulpmiddel bij het herkennen van soorten.

De methode is genoemd naar de uitvinder ervan, de Deense microbioloog Hans Christian Gram (1853-1938), die de techniek in 1884 ontwikkelde voor het onderscheiden van pneumokokken (Streptococcus pneumoniae) van Klebsiella pneumoniae.

Met behulp van deze methode gekleurd, vallen bacteriën namelijk uiteen in twee verschillend aankleurende groepen, die men gramnegatief (rood) of grampositief (blauwpaars) noemt.

Werking[bewerken]

De bacteriën worden eerst gekleurd met een kristalviolet-jodium complex, daarna gewassen met alcohol en vervolgens nagekleurd met waterige fuchsine. Bij grampositieve bacteriën wordt het kristalviolet-jodiumcomplex niet weggewassen door de alcohol; deze cellen kleuren blauwpaars. Gramnegatieve cellen verliezen de eerste kleurstof weer door het alcoholbad; door de nakleuring met fuchsine kleuren ze daarna rood. Van belang is wel, dat voor de gramkleuring enkel bacteriën worden gebruikt uit een 24 uur oude cultuur, omdat in oudere culturen gramvariabiliteit kan optreden.

Verklaring[bewerken]

Het verschil tussen gramnegatieve en grampositieve bacteriën wordt veroorzaakt door een verschil in de structuur van de celwand:

  • Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag welke ondoordringbaar is voor het alcoholmengsel, waardoor deze niet worden ontkleurd.
  • Gramnegatieve cellen hebben buiten het cytoplasmamembraan een heel dunne peptidoglycaanlaag.
Bouw van een gramnegatieve celwand

Buiten de dunne laag peptidoglycaan zit nog een tweede membraan. Dat buitenmembraan bevat lipopolysacchariden (kortweg LPS), die de cel een extra bescherming bieden. Dit lipopolysacharidemembraan is op te delen in 2 soorten:

  • het kernlipopolysacharidemembraan
  • het O-lipopolysacharidemembraan
  • de celwand bevat verschillende antigenen:

H-antigenen: fimbriae O-antigenen: celwand K-antigenen: koolhydraat kapsel

Het kernlipopolysacharidemembraan zit dichter op de bacterie terwijl het O-lipopolysacharidemembraan de buitenste buitenkant is van elke gramnegatieve bacterie. De celwand van gramnegatieve bacteriën verliest het kristal-violet van de eerste kleuring bij het spoelen met alcohol weer en kleuren rood; terwijl de grampositieve de paars-blauwe kleur vasthouden, omdat hun celwand het kristalviolet wel permanent absorbeert ten gevolge van een bindingsreactie met de lugol.

Uitvoering[bewerken]

  • Markeer de bovenkant van een voorwerpglaasje met een krasstaafje
  • Breng op een voorwerpglas met behulp van een entoog een druppel fysiologisch zout (0,9% NaCl) en strijk deze uit (fysiologisch zout is alleen nodig in geval van een 'vaste bacteriecultuur').
  • Suspendeer een zeer geringe hoeveelheid bacteriemateriaal in de druppel en strijk deze uit over het glas (over een oppervlak van ongeveer een euro).
  • Laat drogen aan de lucht (of hoog boven de vlam).
  • Fixeer door driemaal kort door de vlam te halen en laat afkoelen.
  • Kleur het preparaat minstens 1 minuut met kristalvioletoplossing en spoel daarna voorzichtig met water
  • Behandel met lugol (een oplossing van jodium in een kaliumjodideoplossing), 1 minuut.
  • Giet de lugol af (niet spoelen) en ontkleur 20 seconden met 96% alcohol en spoel met water na.
  • Kleur 1 minuut na met waterige fuchsine
  • Spoel goed met water, vloei voorzichtig af tussen filtreerpapier en laat het preparaat drogen aan de lucht. Het kan dan onder de microscoop met olie-immersie worden bekeken (geen dekglaasje!).

Klinische belang[bewerken]

Het maakt voor het beloop van de ziekte en de keuze van de behandeling verschil of de infectie door een grampositieve of een gramnegatieve bacterie veroorzaakt wordt. Over het algemeen treedt penicillineresistentie (ongevoeligheid) bij grampositieve bacteriën minder op dan bij gramnegatieve, tenzij ze het enzym bèta-lactamase kunnen produceren. Bij resistentie liggen een lactamase resistent smal spectrum penicilline, zoals flucloxacilline, of toevoeging van de lactamaseremmer clavulaanzuur meer voor de hand dan breedspectrum penicillines zoals amoxicilline. Gramnegatieve bacteriën zorgen met hun LPS-laag dat het menselijk immuunsysteem daar sterk op reageert; de dode bacteriën zijn zelf een endotoxine, waar je ziek van kunt worden. Een exotoxine is een gifstof die een (meestal grampositieve) bacterie (zoals de difterie- of de tetanusbacterie of ook Stafylococcus aureus) produceert.

Voorbeelden[bewerken]

Enkele voorbeelden van grampositieve (gram+) bacteriën zijn:

Enkele voorbeelden van gramnegatieve (gram–) bacteriën zijn:

Jonge culturen van Clostridium zijn meestal grampositief, oudere meestal gramnegatief.

In de volgende tabel enkele grampositieve en -negatieve bacteriën die in een direct preparaat zichtbaar kunnen zijn:

ziekteverwekker onder microscoop gevonden in ziekte bacteriesoorten antibiotica[1]
Gramnegatieve kokken urethrale uitvloed of vaginale afscheiding gonorroe gonokokken penicilline eventueel met clavulaanzuur
Gramnegatieve kokken liquor (ruggenprik) hersenvliesontsteking meningokokken penicilline
Grampositieve kokken in rijtjes of tweetallen sputum, pus longontsteking; wondinfectie; Streptokokkensoorten penicilline
Grampositieve kokken in groepjes pus wondinfecties, huidinfecties, botinfectie Stafylococcus aureus; flucloxacilline, penicilline met clavulaanzuur
Gramnegatieve staafjes urine; sputum urineweginfectie; luchtweginfectie Vele; onder meer E. Coli; Enterobacteriaceae; Proteus; Klebsiella; Haemophilus influenzae; Pseudomonas aeruginosa Amoxicilline, andere breedspectrumantibiotica
Grampositieve staafjes ascitesvocht; gangreen Listeriose; gasgangreen Listeria monocytogenes, Bacterioides Penicilline, vanwege de ernst vaak met een aminoglycoside

Zie ook[bewerken]

Noten[bewerken]

  1. Review of Medical Microbiology Jawetz, Melnick, Adelberg, 16th ed;: Lange, LA 1984, p 137