Western blot

Uit Wikipedia, de vrije encyclopedie
Ga naar: navigatie, zoeken
Een elektroforeseopstelling. Door de gel loopt een stroom waardoor de negatief geladen eiwitten naar beneden migreren.

Een western blot is een biochemische techniek waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van eiwitten door middel van antilichamen gedetecteerd kan worden. In het algemeen worden de eiwitten in het eiwitmengsel (bijvoorbeeld een cellysaat) eerst gescheiden op basis van hun grootte of beter gezegd, moleculair gewicht door middel van een SDS-PAGE-gel (gelelektroforese). Vervolgens worden de eiwitten die gescheiden zijn op grootte van de gel "overgebracht" naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan waar ze vervolgens aan hechten. Dit proces wordt blotten genoemd.

Detectie van eiwitten na het blotten[bewerken]

Indirect m.b.v. antilichamen[bewerken]

Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste antilichaam gebonden heeft en het eiwit zich dus bevindt.

Western blot waarbij liponzuur gemodificeerde eiwitten zichtbaar zijn gemaakt met een rood fluorescerend tweede antilichaam

Direct m.b.v. kleurstoffen of autoradiografie[bewerken]

Na blotten kan de membraan ook gekleurd worden met specifieke kleurstoffen zoals Ponceau-S om alle overgebrachte eiwitten zichtbaar te maken.

Nitrocellulosemembraan gekleurd met Ponceau-S. De blauwe banden aan de linkerkant zijn markereiwitten voor bepaling van het moleculair gewicht

Indien de eiwitten zelf gelabeld zijn, bijvoorbeeld met radioactief zwavel, kunnen ze na blotten zichtbaar worden gemaakt met een autoradiogram.

Western blot waarbij radioactief gelabelde eiwitten zichtbaar zijn gemaakt d.m.v. autoradiografie