Polymerasekettingreactie

Apparatuur en resultaten van een PCR. Boven: reactiebuisjes in een PCR-machine. Onder: een strip met PCR-buisjes en een gelelektroforese met verschillende PCR-producten geladen.

De polymerasekettingreactie of PCR (polymerase chain reaction), is een laboratoriumtechniek waarmee een specifiek stukje DNA vele malen kan worden vermenigvuldigd (geamplificeerd). Uit een uiterst kleine hoeveelheid materiaal kan via PCR voldoende DNA worden verkregen voor verdere analyse. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1980 door biochemicus Kary Mullis is PCR uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in de moleculaire biologie.

PCR wordt breed toegepast in zowel fundamenteel onderzoek als in praktische domeinen zoals medische diagnostiek, forensisch onderzoek, genetische modificatie en infectieziektebestrijding. Dankzij PCR kunnen bijvoorbeeld virussen zoals hiv of SARS-CoV-2 worden opgespoord in een vroege infectiefase, wanneer er nog weinig genetisch materiaal aanwezig is. Ook wordt de techniek gebruikt om DNA-profielen te maken bij gerechtelijk onderzoek of om genetische mutaties op te sporen bij erfelijke aandoeningen.

De kracht van PCR ligt in het vermogen om uiterst nauwkeurig een specifiek DNA-fragment te vermenigvuldigen. Dit gebeurt met behulp van een enzym, DNA-polymerase, dat een nieuwe streng bouwt op basis van een bestaande DNA-template. Hierbij worden korte synthetische stukjes DNA, zogeheten primers, gebruikt om het beginpunt van de gekozen DNA-sequentie aan te geven. Het principe van PCR is gebaseerd op het herhaaldelijk verhitten en afkoelen van het DNA, die het DNA afwisselend denatureren, primers laten binden en nieuwe strengen laten vormen.

Geschiedenis

Het principe van PCR werd al in de jaren 1970 beschreven, maar de uitvinding van de techniek wordt meestal toegeschreven aan de Amerikaanse biochemicus Kary Mullis in 1983. Mullis was werkzaam was bij het biotechbedrijf Cetus Corporation, waar hij zich bezighield met synthetische oligonucleotiden. Hij kwam op het idee om met behulp van korte primers en een DNA-polymerase een specifiek DNA-fragment cyclisch te vermenigvuldigen: in grote lijnen hetzelfde concept als PCR in zijn moderne vorm. In de beginjaren verliep het proces omslachtig, omdat men gebruik maakte van een polymerase uit E. coli, die niet hittebestendig was en bij iedere cyclus opnieuw moest worden toegevoegd. De ontdekking van Taq-polymerase, geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus, maakte PCR veel efficiënter en praktischer, aangezien dit enzym bestand is tegen de hoge temperaturen die nodig zijn voor de denaturatie van DNA.

Baby Blue, een prototype uit 1986 van een automatische PCR-machine

Vanaf het midden van de jaren tachtig verspreidde PCR zich naar andere delen van de wereld via onderzoekslaboratoria, zo ook in Nederland en België. De techniek vond zijn toepassing aanvankelijk vooral in de klinische diagnostiek, bijvoorbeeld van hiv-infectie. Veiligheidsdiensten zoals de FBI begonnen de techniek begin vanaf 1986 ook voor het eerst te valideren voor forensisch sporenonderzoek. In 1989 verkocht Cetus de rechten op PCR aan Roche, wat de commerciële verspreiding verder versnelde. In de jaren daarna volgden technologische verfijningen van het systeem, en afgeleide technieken zoals kwantitatieve PCR. Het laatste commerciële PCR-octrooi verliep in 2017.

Kary Mullis ontving in 1993 de Nobelprijs voor Scheikunde voor de uitvinding, samen met Michael Smith, die werd bekroond voor zijn werk aan gerichte mutagenese met oligonucleotiden. Hoewel Mullis' ontdekking in eerste instantie sceptisch werd ontvangen door collega's, wordt zijn idee erkend als een van de meest invloedrijke biochemische innovaties van de twintigste eeuw.

Werking van de reactie

Meer informatie: DNA-replicatie

De uitvinding van PCR was een mijlpaal in de moleculaire biologie en betekende een doorbraak in de manier waarop men werkt met DNA en RNA. Het stelde onderzoekers in staat om een stukje genetisch materiaal, zoals een gen of andere sequentie, selectief te vermenigvuldigen in een reageerbuis. Tot aan de jaren 1980 gebeurde dit meestal aan de hand van kloneringsmethoden in bacteriën, een langzaam en arbeidsintensief proces. Omdat bacteriën bij PCR niet nodig zijn, is de techniek snel en eenvoudig uitvoerbaar: het genereert miljarden kopieën van een DNA-fragment in enkele uren. Uitgaande van het totale genoom, kan men met PCR een gewenst stukje DNA – geselecteerd door de onderzoeker – door vermenigvuldiging 'zuiveren' van de rest van het genetisch materiaal, dat niet wordt vermenigvuldigd.

De kunstmatige vermenigvuldiging van nucleïnezuren, ook wel amplificatie genoemd, is exponentieel van aard. Dit betekent dat zelfs minuscule hoeveelheden van een nucleïnezuur snel kunnen worden vermeerderd tot detecteerbare niveaus. De PCR-techniek is bijvoorbeeld gevoelig genoeg om sporen van DNA te detecteren in een druppel bloed die achtergelaten is op een plaats delict, of om enkele kopieën van een virusgenoom in iemands speeksel aan te tonen.

Componenten en reagentia

De reactiemengsels voor PCR worden vaak in kleine buisjes (van 20–50 microliter) gereedgemaakt

Om een PCR uit te voeren, wordt het DNA (geïsoleerd uit een monstermateriaal) in een buisje gemengd met een aantal reactiecomponenten. Een hoofdrol speelt DNA-polymerase, een enzym dat de taak heeft om het aangeleverde DNA te kopiëren. Omdat tijdens PCR verhit wordt naar hoge temperaturen, moet het gebruikte enzym hittebestendig zijn. Thermostabiele polymerasen – zoals het klassieke Taq-polymerase uit de warmteminnende bacterie Thermus aquaticus – bleken hiervoor ideaal. In de loop der jaren zijn er vele varianten op de markt gekomen, sommige geoptimaliseerd voor snelheid, andere voor nauwkeurigheid.

Om DNA te kopiëren, heeft het polymerase een zogeheten primer nodig: een kort DNA-fragment van 18–25 nucleotiden dat een beginnetje vormt en dus bepaalt waar de polymerisatie van start gaat. Voor de reactie zijn altijd twee verschillende primers nodig: één voor elke streng van het dubbelstrengse DNA. De primers worden door de onderzoeker ontworpen en chemisch gesynthetiseerd. DNA-primers kunnen zo worden ontworpen dat ze elke gewenste positie in een genoom herkennen. Door te binden aan de complementaire sequenties van het genetisch materiaal, leiden zij het polymerase naar het deel van het genoom dat moet worden gekopieerd.

Naast het DNA-polymerase en primers worden er nog een aantal andere stoffen toegevoegd aan de reactiemix. De reactie heeft een fikse hoeveelheid vrije nucleotiden (dNTP's) nodig: dit zijn de bouwstenen die ingebouwd worden in de groeiende DNA-keten. Verder bevat de reactiemix een buffer om pH en zoutconcentraties te stabiliseren, en magnesiumionen (toegevoegd als magnesiumchloride), die nodig zijn voor de activiteit van het polymerase. Alle componenten van de reactie zijn commercieel verkrijgbaar en worden meestal ingekocht. De reagentia worden in kleine buisjes gepipetteerd in vaste hoeveelheden; een voorbeeld van een standaard PCR-mix is hieronder weergegeven.

Component	Volume
PCR-buffer	5,0 μL
dNTP-mix (10 mM)	1,0 μL
Twee primers (10 μM)	2,5 μL
Template-DNA	1,0 μL
DNA-polymerase	0,5 μL
Steriel water	37,0 μL

Reactieverloop

Principe van PCR. Het DNA wordt kortstondig verhit zodat de strengen uit elkaar gaan (denaturatie). Dan wordt het DNA afgekoeld zodat de primers kunnen hechten aan de randen van het te vermenigvuldigen fragment (annealing). Vervolgens wordt verwarmd tot de optimale temperatuur van de polymerase (elongatie).

Het principe van PCR berust op het achtereenvolgens verhitten en afkoelen van de reactiemix. De reactie is iteratief, wat wil zeggen dat dezelfde amplificatiestappen herhaaldelijk worden uitgevoerd in opeenvolgende cycli. De PCR-cyclus bestaat globaal uit drie stappen: denaturatie, annealing en elongatie.

• Denaturatie (ca. 94–96 °C). De reactiemix wordt verhit, waardoor de twee strengen van het dubbelstrengse DNA uit elkaar gaan. De hitte zorgt ervoor dat de waterstofbruggen tussen de complementaire DNA-ketens loslaten. Hierdoor ontstaan enkelstrengs DNA-moleculen die als matrijs (template) dienen voor de volgende stap.
• Annealing (ca. 55–65 °C). De temperatuur wordt verlaagd zodat de korte primers kunnen binden aan hun complementaire sequenties op het enkelstrengs DNA. Deze primers markeren de linker- en rechtergrens van het DNA-fragment dat moet worden vermenigvuldigd. De annealingtemperatuur hangt af van het smeltpunt (Tm) van de primers en bepaalt de specificiteit van de PCR.
• Elongatie (ca. 72 °C). Het DNA-polymerase begint met het inbouwen van nieuwe nucleotiden. De nucleotiden worden toegevoegd aan het 3'-uiteinde van de gebonden primers (de primers worden 'verlengd'). Zo wordt op elke enkelstrengs keten een nieuwe complementaire streng gevormd. Na deze stap is de hoeveelheid dubbelstrengs DNA verdubbeld.

Na afloop van elke cyclus dienen de nieuw gemaakte DNA-moleculen als sjabloon voor de volgende ronde. Dit proces herhaalt zich 20–30 keer, waardoor er miljarden kopieën van het gekozen DNA-fragment ontstaan. In moderne laboratoria wordt het reactieproces automatisch uitgevoerd in een PCR-machine. Het succes van PCR is een kwestie van juist getimede temperatuursveranderingen. Optimalisatie van de reactiecondities is een proefondervindelijk proces.

Omdat in elke cyclus het aantal DNA-moleculen verdubbelt, neemt de hoeveelheid product exponentieel toe. In theorie zou elke cyclus een exacte verdubbeling opleveren (2ⁿ), maar in de praktijk daalt de efficiëntie geleidelijk naarmate de reactie vordert. Dit komt doordat de concentratie van primers en nucleotiden afneemt en het enzym minder actief wordt.

De exponentiële werking van PCR. Na elke ronde van DNA-synthese dienen de nieuw gemaakte fragmenten weer als sjabloon voor de synthese van nieuwe DNA-strengen. Omdat het polymerase en primers in de reageerbuis aanwezig blijven, bestaat de procedure uit niets meer dan herhaaldelijk verhitten en afkoelen van hetzelfde monster.

De exponentiële werking van PCR. Na elke ronde van DNA-synthese dienen de nieuw gemaakte fragmenten weer als sjabloon voor de synthese van nieuwe DNA-strengen. Omdat het polymerase en primers in de reageerbuis aanwezig blijven, bestaat de procedure uit niets meer dan herhaaldelijk verhitten en afkoelen van hetzelfde monster.

Detectie van het PCR-product

Na afloop van een PCR-reactie wordt vaak gecontroleerd of de amplificatie is geslaagd en het juiste fragment is verkregen. Dit gebeurt doorgaans met behulp van een agarose-gelelektroforese, een techniek waarmee men DNA-fragmenten op lengte kan scheiden en daarna zichtbaar kan maken met een fluorescente kleurstof. De PCR-producten worden in de gel in kleine holtes geplaatst (geladen) en onder invloed van een elektrisch veld bewegen de fragmenten door de gel. Kleinere fragmenten gaan sneller en komen verder, grotere fragmenten migrereren trager. Zo ontstaat er een scheiding van het DNA naar fragmentgrootte.

Resultaat van een agarose-gel met PCR-producten geladen. De DNA-ladders zijn uiterst links en rechts zichtbaar; de 16 lanen in het midden tonen verschillende DNA-fragmenten, verkregen door PCR, gescheiden op lengte.

Wanneer de gel onder speciaal licht wordt bekeken, verschijnen de DNA-fragmenten als bandjes. Elk bandje vertegenwoordigt een groep fragmenten van ongeveer dezelfde lengte. Door dit bandenpatroon te vergelijken met een standaard, de zogeheten DNA-ladder (die een reeks fragmenten van bekende groottes bevat), kan worden vastgesteld of het juiste PCR-fragment aanwezig is. De aanwezigheid van een specifieke band kan bijvoorbeeld dienen als bewijs voor de aanwezigheid van een virus in het oorspronkelijke DNA-monster. Omdat men met gelelektroforese alleen de aan- of afwezigheid van een PCR-product kan zien, wordt deze uitleesmethode kwalitatief genoemd.

Na deze eerste controle zijn er verschillende vervolgstappen mogelijk, afhankelijk van het doel van de PCR. Als het juiste fragment aanwezig is, kan het PCR-product worden opgestuurd voor sequencing, om de exacte basenvolgorde vast te stellen. Als men het fragment wil gebruiken voor genetische technologie of expressie van een recombinant eiwit, kan het worden ingebouwd in een vector voor klonering.

Variaties en technieken

Kwantitatieve PCR

Amplificatiecurven van een qPCR. De grafiek toont de toename van fluorescentie (y-as) tijdens opeenvolgende PCR-cycli (x-as). Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt een monster. De rode lijn markeert de drempelwaarde, het punt waarop de fluorescentie boven de achtergrond uitstijgt. Monsters met meer start-DNA bereiken deze drempel bij een lager aantal cycli.

In de loop van de decennia zijn er verschillende technische varianten van PCR ontwikkeld om de methode toepasbaar te maken voor vernieuwende onderzoeksdoeleinden. Een van de meest prominente afgeleide technieken is kwantitatieve PCR (qPCR), een technologie waarmee men de hoeveelheid DNA in een onderzoeksmonster nauwkeurig kan meten.

Kwantitatieve PCR maakt gebruik van chemische kleurstoffen (dyes) die fluoresceren wanneer ze aan dubbelstrengs DNA binden. In tegenstelling tot een klassieke PCR, waarbij het resultaat pas na afloop van de reactie zichtbaar is, wordt bij qPCR de fluorescentie gedurende het hele reactieverloop gemeten. Naarmate er meer DNA wordt geamplificeerd, neemt het fluorescentiesignaal toe.

De kwantificatie gebeurt aan de hand van een zogenaamde Ct-waarde. Dit is het moment waarop de fluorescentie de achtergrondruis duidelijk overstijgt. Hoe meer startmateriaal aanwezig is, hoe eerder dit punt wordt bereikt. Door de gemeten Ct-waarden te vergelijken met een referentiestandaard of ijklijn, kan de aanvangshoeveelheid van het gekozen DNA-fragment worden berekend.

RT-qPCR

De qPCR-methode wordt in de biologie zeer algemeen gebruikt om genexpressie te analyseren. Hiervoor kijkt men naar de niveaus van messenger-RNA (mRNA) in de cel, het boodschappermolecuul dat bepaalt welke genen tot uiting komen. Het RNA wordt uit een cel of weefsel geïsoleerd, en middels reverse-transcriptase omgezet in een DNA-kopie genaamd cDNA, dat vervolgens in de qPCR-machine kan worden uitgelezen. Deze variant wordt ook wel RT-qPCR genoemd. RT-PCR wordt routinematig toegepast bij de diagnostiek van RNA-virussen, zoals SARS-CoV-2 of griepvirussen. RT-qPCR wordt daarnaast gebruikt voor het diagnosticeren van erfelijke aandoeningen waarin de genexpressie verstoord is, zoals bij het syndroom van Lesch-Nyhan.

Multiplex PCR

Lange tijd konden onderzoekers met PCR slechts één specifiek DNA-fragment per reactie amplificeren, iets wat voldoende was voor veel toepassingen in diagnostiek en genetica. In de forensische wetenschap ontstond echter de wens om zoveel mogelijk genetische informatie uit een omgevingsmonster te verkrijgen. Hoe meer informatie er uit het achtergelaten DNA kan worden verzameld, hoe groter het vermogen om verdachten van niet-verdachten te onderscheiden.

Om dit mogelijk te maken werd multiplex PCR ontwikkeld. Bij multiplex PCR is het mogelijk om meerdere DNA-fragmenten in één reactie te amplificeren. Dit gebeurt door het toevoegen van meedere primerparen in één reactiemix, elk specifiek voor een andere sequentie. Een belangrijke voorwaarde is dat alle primers vergelijkbare smelttemperatuur hebben, zodat ze onder dezelfde reactiecondities functioneren. Met behulp van deze techniek kan men een relatief sterk DNA-profiel (STR-profiel) reconstrueren bestaande uit meerdere loci. Multiplex PCR wordt ook toegepast om snel meerdere pathogenen in patiëntenmateriaal te screenen.

Toepassingen

Kloneren van DNA

PCR-apparaten in een onderzoekslab

PCR is een uitgegroeid tot een standaardtechniek in de moleculaire biologie. Selectieve amplificatie van DNA betekende een omwenteling binnen vele biologische vakgebieden waaronder genetica, biotechnologie, epidemiologie, moleculaire systematiek en fylogenie. De techniek lag ten grondslag aan de voltooiing van het menselijk genoomproject: de ontcijfering van de menselijke DNA-code. Het isoleren van een gewenste DNA-sequentie was daarnaast fundamenteel voor de ontwikkeling van genetische technologie.

Een van de grootste toepassingen binnen fundamenteel onderzoek is genklonering. Onderzoekers gebruiken PCR om een gen uit een organisme te isoleren, dit stukje DNA vervolgens in een zogenaamde vector te plaatsen, en dit in een gewenst gastheerorganisme te introduceren. Door het geïsoleerde stukje DNA in een levend organisme te brengen, zoals een bacterie of een plant, kan men de functie van dit gen in groot detail bestuderen. Met deze recombinant-DNA-technologie kan men ook om een gekloond gen in een expressievector te zetten, waarmee grote hoeveelheden van een commercieel interessant eiwit kan worden geproduceerd, zoals insuline, vaccins en industriële enzymen.

Medische diagnostiek

De PCR-methode heeft mogelijk gemaakt om erfelijke aandoeningen en infectieziekten veel sneller en specifieker op te sporen dan met conventionele methoden, zoals serologische tests of celkweek. In het klinisch laboratorium is het sinds de introductie van PCR mogelijk geworden om minieme hoeveelheden DNA of RNA te detecteren en te analyseren, zelfs in gering patiëntmateriaal.

Een PCR-testlocatie in Japan tijdens de coronapandemie

In de virologie is PCR een onmisbare methode geworden voor de detectie van virale infectie. Zowel DNA-virussen (zoals hepatitis B) als RNA-virussen (zoals influenza, SARS-CoV-2 en hiv) worden in de moderne geneeskunde routinematig opgespoord middels PCR-testen. Infecties kunnen vaak al in een vroeg stadium worden vastgesteld, zelfs voordat symptomen optreden. Kwantitatieve PCR wordt daarnaast gebruikt om de virale lading te meten, bijvoorbeeld bij hepatitis C-patiënten. Uitslagen hiervan vormen een belangrijk hulpmiddel voor het kiezen van de therapie. PCR wordt eveneens toegepast in bacteriële en parasitaire diagnostiek, onder meer bij tuberculose, chlamydia en malaria. In medische onderzoeksinstituten en bloedbanken wordt PCR ingezet voor screening op infectieuze agentia.

Bij het onderzoek naar erfelijke aandoeningen wordt gezocht naar specifieke genen of mutaties te identificeren die verband houden met ziekten zoals cystische fibrose, sikkelcelanemie en de ziekte van Huntington. Ziektespecifieke DNA-gebieden kunnen dankzij PCR snel in het laboratorium worden aangetoond zonder volledige genoomanalyse. PCR vormt ook de basis van prenatale screenings en genetische diagnostiek bij in-vitrofertilisatie.

Forensische analyse

Vaak worden er op misdaadlocaties DNA-monsters afgenomen en met behulp van PCR geanalyseerd

Een belangrijk streven in de forensische wetenschap is het verkrijgen van een DNA-profiel op basis van achtergelaten materiaal op de plaats delict. Dit profiel, ook wel de genetische vingerafdruk genoemd, is voor ieder individu uniek (met uitzondering van eeneiige tweelingen) en vormt daardoor een sterk identificatiemiddel bij strafrechtelijk onderzoek.

Voor forensische PCR gebruikt men DNA uit uiteenlopende monstermaterialen, zoals bloed, sperma, speeksel, huidcellen of haren met meegekomen wortelcellen. Met PCR worden specifieke, niet-coderende DNA-regio’s geamplificeerd die bestaan uit herhalingen van korte sequenties, zogenoemde short tandem repeats (STR’s). Het aantal herhalingen in elk STR-locus varieert sterk tussen individuen, wat resulteert in fragmenten van verschillende lengtes na amplificatie.

Door meerdere STR-loci gelijktijdig te analyseren ontstaat een karakteristiek patroon van DNA-fragmenten dat met grote statistische zekerheid een individu kan identificeren of uitsluiten. Deze techniek wordt toegepast bij het vergelijken van sporenmateriaal met DNA van verdachten, het vaststellen van verwantschappen (zoals vaderschapsonderzoek) en bij identificatie van slachtoffers van een ramp.

Beperkingen en foutgevoeligheid

Meer informatie: Sensitiviteit en specificiteit

Een PCR-ruimte met verschillende thermocyclers; instrumenten en werkruimtes moeten vrij blijven van contaminatie

PCR wordt toegepast in domeinen waar betrouwbaarheid cruciaal is. De ontvoerend onderzoeker moet strikte controles en standaardisatie hanteren om nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van resultaten te verzekeren. Bij onzorgvuldige uitvoering kunnen door technische of analytische fouten diverse validiteitsproblemen optreden.

De hoge gevoeligheid van PCR maakt het mogelijk om minimale hoeveelheden DNA te detecteren, maar diezelfde eigenschap maakt de methode ook vatbaar voor contaminatie. Zelfs kleine sporen van vreemd DNA – afkomstig van de onderzoeker zelf, uit de omgeving of apparatuur – kunnen worden meegeamplifcieerd en zo leiden tot valspositieve resultaten. In diagnostische PCR kan bovendien genetisch materiaal van een eerdere infectie, waarvan de patiënt inmiddels is hersteld, opnieuw worden gedetecteerd. Dit kan worden voorkomen door instrumenten steriel te houden, en het aantal ingestelde PCR-cycli zo laag mogelijk te houden.

De specificiteit van PCR wordt bepaald door de precisie waarmee primers binden aan hun doelsequentie. Onvolledige of aspecifieke annealing kan leiden tot kruisreactiviteit, een verschijnsel waarbij niet alleen het beoogde fragment, maar ook andere stukjes DNA worden vermenigvuldigd. In genomisch DNA met veel herhalende sequenties of homologieën tussen genfamilies is dit een relatief veelvoorkomend probleem.

Een andere beperking van PCR betreft de variabele efficiëntie van de reactie. Onder bepaalde omstandigheden kan amplificatiebias optreden, waarbij sommige sequenties efficiënter worden vermenigvuldigd dan andere. Dit leidt tot een vertekende weergave van de relatieve hoeveelheden in het oorspronkelijke monster. In metagenomische onderzoeken worden GC-rijke sequenties vaak ondervertegenwoordigd, omdat ze moeilijker denatureren en minder efficiënt worden gekopieerd.

Zie ook

• DNA-sequencing

Literatuur

• (en) Alberts B, Heald R, Johnson A. (2022). Molecular Biology of The Cell, 7th. W.W. Norton & Company, pp. 498-511. ISBN 978-0-393-42708-0.
• (en) Glick BR, Patten CL. (2022). Molecular Biotechnology, 6th. John Wiley & Sons. ISBN 978-1-68367-366-8.
• (en) Bustin, SA. (2010). The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications. Cambridge University Press. ISBN 978-0-521-88231-6.
• Orelio CC, Plug MJ. (2025). Basisprincipes van de PCR, 4e. Syntax Media. ISBN 978-94-91764-61-5.
• Prinsen J, van der Leij F. (2025). De bouwstenen van het leven, 4e. Wageningen Academic Publishers, pp. 454-472. ISBN 978-90-04-72085-5.

Voetnoten

Bronnen

Mediabestanden

Zie de categorie Polymerase chain reaction van Wikimedia Commons voor mediabestanden over dit onderwerp.