Primer

Uit Wikipedia, de vrije encyclopedie
Ga naar: navigatie, zoeken
Icoontje doorverwijspagina Zie Primer (doorverwijspagina) voor andere betekenissen van Primer.

Een primer is een klein stukje DNA of RNA dat gebruikt wordt als startpunt van de polymerasekettingreactie (PCR, polymerase chain reaction). Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5'-streng en één voor de 3'-streng. Deze worden de forward en de reverse primer genoemd.

De beste primer voor een PCR is een korte streng, waarvan de sequentie alleen overeenkomt met het stuk DNA voor het DNA-fragment (vaak een gen/exon)en na het DNA-fragment dat men wil dupliceren. Is dit namelijk niet het geval, dan zal de primer op meerdere plaatsen binden aan het DNA en dus stukken gaan dupliceren die niet gewenst zijn.

Vanaf de primer wordt het DNA richting 5' gekopieerd.

RNA-primers spelen een belangrijke rol bij de replicatie van DNA, ze vormen hier de startpunten van de Okazaki-fragmenten in de lagging strand.

Samenstelling[bewerken]

De ideale primer is tussen de 18 en 22 baseparen lang, bevat 50% GC-nucleotiden en bestaat uit een willekeurig mengsel van nucleotiden. Het punt waarop de DNA-streng uit elkaar gaat (Tm) wordt het 'smeltpunt' (denaturatie) genoemd en ligt van een dergelijke primer tussen de 50 °C en 68 °C. Beide primers moeten eenzelfde smeltpunt hebben. Hoe langer de primer is des te hoger is het smeltpunt.

Een primer mag geen homoloog stukje groter dan 3 baseparen bevatten, omdat anders de primer tijdens de periode van paring kan dubbelvouwen en zo een dubbele streng met zich zelf kan maken, waardoor de primer niet aan de te repliceren DNA-streng gaat zitten. Ook mogen de twee primers geen homoloog stukje bevatten, omdat anders de twee primers met elkaar hybridiseren.

Een primer moet uit ongeveer 45% tot 55% GC-nucleotiden bestaan en mag geen PolyG- of PolyC-stukjes bevatten, omdat anders geen specifieke paring optreedt. Hoe korter de primer is hoe meer GC-nucleotiden de primer moet bevatten voor ideale primer, is de primer langer dan is het van belang dat hij meer AT-nucleotides bevat. Poly A- en Poly T-stukjes moeten voorkomen worden, omdat deze de efficiëntie van de amplificatie nadelig beïnvloeden. Ook polypyrimidine (T, C) en polypurine (A, G) stukjes mogen niet in een primer voorkomen.

Aan het 3' eind van de primer moet een C of een G zitten, omdat deze nucleotiden door drie bruggen een sterkere waterstofbrug vormen.

Bij de reverse primer moeten of de 3' en 5' omgewisseld worden, of het begin en eind omgekeerd worden. Dit laatste is beter voor een overzichtelijke primer. Ook moeten de ATCG omgewisseld worden voor de tegenovergestelde letter. Voorbeeld:

forward: 3' ATCG '5

reverse: 3' CGAT '5

(deze voorbeelden voldoen niet aan de eisen van de primer, maar gaat om het voorbeeld van de opbouw van de reverse primer)

Belangrijkste eisen van een primer:

  1. Uniekheid, liever een lange primer dan een vrij korte die meer op een stukje DNA lijkt die vrij veel overeenkomt met een bestaand stukje.
  2. TM waarde, deze moet van de forward en reverse zo dicht mogelijk bij elkaar liggen. Verschil is maximaal 4 graden, en het liefst niet meer dan 2 graden onder de anhealings-temperatuur en bij voorkeur zeker niet erboven omdat dan maar 50% hooguit bindt.

PCR[bewerken]

PCR-schema

PCR is een techniek om DNA-strengen vele malen te vermenigvuldigen.

  1. Door de DNA te verhitten tot tussen de 90 en 96 °C gaan de twee strengen uit elkaar (denaturatie).
  2. Vervolgens hechten de primers zich bij een tot tussen de 60 en 68 °C langzaam dalende temperatuur aan de twee enkelvoudige DNA-strengen.
  3. Bij 72 °C wordt door DNA-polymerase de primer richting 5' verlengd, waardoor er twee stukken dubbele DNA-strengen ontstaan.
  4. Nu worden deze stukjes weer door verhitting gesplitst in enkelstrengs-DNA enz. Daar de aanwezige primers voorkeursparing hebben met de twee enkelstrengs-DNA die een verlenging zijn van deze primers worden alleen deze DNA stukken gerepliceerd. Na enkele cycli is er zoveel DNA aangemaakt dat deze aangetoond kan worden met gelelektroforese.