Spoorlijn 301 (ook bekend onder de naam Železniční trať Nezamyslice – Olomouc, wat Spoorlijn Nezamyslice – Olomouc betekent) is een spoorlijn in Tsjechië. De lijn verzorgt, samen met spoorlijn 300 de verbinding van Brno met Olomouc. Lijn 301 loopt van de vlek Nezamyslice, via Prostějov, naar Olomouc, de hoofdstad van de gelijknamige regio. De lijn is in 1870 in gebruik genomen. Over het traject rijden verschillende stop- en sneltreinen. Over de lijn rijdt de Tsjechische staatsmaatschappij České dráhy.[1]