Fluorescentie-in-situhybridisatie

Microscopische opname van chromosomen waarin met FISH een genherschikking is aangetoond. Zulke herschikkingen zijn kenmerkend voor bepaalde vormen van leukemie.

Fluorescentie-in-situhybridisatie^[1] (afgekort FISH^[1]) is een techniek waarbij chromosoom(delen) aangekleurd worden en vervolgens onder de fluorescentiemicroscoop bestudeerd kunnen worden. Deze techniek wordt in de cytogenetica gebruikt om ziektes op te sporen die het gevolg zijn van chromosoomafwijkingen, zoals een translocatie of een trisomie.

De techniek werd ontwikkeld door biomedische onderzoekers in de jaren 1980 om de aanwezigheid en ligging van bepaalde DNA-sequenties in chromosomen te detecteren. Het principe van fluorescentie-in-situhybridisatie berust op het gebruik van korte, fluorescent-gelabelde DNA-probes die door de onderzoeker ontworpen worden, en zich binden (hybridiseren) aan een specifieke doelsequentie op het genetisch materiaal via complementaire basenparing.

Naast de detectie van chromosoomafwijkingen wordt de techniek ook ingezet in kankerdiagnostiek, bijvoorbeeld om genamplificaties vast te stellen die relevant zijn voor diagnose, prognose en therapiekeuze. FISH wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om het philadelphiachromosoom vast te stellen bij chronische myeloïde leukemie, een specifieke translocatie tussen chromosomen 9 en 22.

Principe

Het principe van FISH berust op het gebruik van een fluorescent-gelabelde probe, een enkelstrengs RNA- of DNA-fragment dat complementair is aan een specifieke sequentie op een chromosoom. Door complementaire basenparing bindt de probe alleen aan het stukje genetisch materiaal waarin de onderzoeker geïnteresseerd is. Zo kan een probe worden ontworpen om een enkel gen of een groter chromosomaal gebied te detecteren.

De probe is meestal covalent gebonden aan een fluorofoor, een molecuul dat oplicht wanneer het wordt bestraald met licht van een specifieke golflengte. Er bestaan verschillende fluorochromen die elk een andere kleur uitstralen onder de fluorescentiemicroscoop. Dit maakt het mogelijk om meerdere probes gelijktijdig te gebruiken en zo verschillende DNA- of RNA-sequenties in één preparaat te onderscheiden.

Door de hybridisatie kan men nauwkeurig bepalen waar een bepaald gen of chromosomaal gebied zich bevindt in een cel of weefsel. Zo kan FISH bijvoorbeeld gebruikt worden om chromosoomtranslocaties, genamplificaties of deleties te detecteren.

Procedure

De probe wordt volgens de gewenste specificaties ontworpen en gefabriceerd. Vervolgens wordt een chromosoompreparaat gemaakt: cellen van de patiënt worden in de metafase van de celdeling gebracht, waardoor de chromosomen condenseren en goed zichtbaar worden. In deze fase worden de cellen met hun chromosomen vervolgens gefixeerd op een glasplaatje. De fluorescerende probes worden hieraan vervolgens toegevoegd en men laat deze hybridiseren (hechten) aan het DNA in de chromosomen. De probes die zich niet gehecht hebben, worden vervolgens weggewassen, waarna het glasplaatje onder de fluorescentiemicroscoop onderzocht kan worden.

Toepassingen

FISH wordt vooral gebruikt voor prenatale diagnostiek (van bijvoorbeeld trisomie 21 - het syndroom van Down), en onderzoek op bepaalde typen kankercellen, zoals de Philadelphia translocatie (t9:22) bij chronische myeloïde leukemie (CML).

Whole-chromosome painting

De probe wordt bij deze techniek zo ontworpen, dat deze hecht aan zeer grote delen van één specifiek chromosoom. Ook kunnen er enige verschillende probes gebruikt worden met verschillende kleuren, zodat men twee of drie verschillende chromosomen zichtbaar kan maken. Deze techniek kan men gebruiken om een afwijkend aantal van een specifiek chromosoom vast te stellen, of om translocaties (uitwisselingen van stukken chromosoom) tussen twee chromosomen aan te tonen (hierbij moet men dan wel van tevoren weten, om welke chromosomen het gaat, zodat de juiste probes gebruikt kunnen worden).

Voor trisomie 21 kan men bijvoorbeeld een FISH-probe gebruiken die specifiek aan chromosoom 21 hecht, waarbij men dan drie kopieën van dit chromosoom zal zien aankleuren per cel. Bij translocaties zullen de twee verschillende kleuren die men voor de twee verschillende chromosomen gebruikt heeft, samen op één chromosoom voorkomen en soms zelfs "door elkaar lopen".

M-FISH

Een cel in metafase die positief is voor de bcr/abl translocatie. Het chromosoom dat zowel groene als rode puntjes bevat (links midden) is het afwijkende chromosoom met de translocatie.

Bij deze techniek gebruikt men 24 verschillende probes met 24 (enigszins) verschillende kleuren, die elk specifiek zijn voor één chromosoom (1 t/m 22, X en Y afzonderlijk). Hierdoor kan men snel zien, of het juiste aantal chromosomen aanwezig is, welk chromosoom eventueel dubbel aanwezig is of ontbreekt, en of er eventueel chromosomale afwijkingen aanwezig zijn. Omdat de kleuren toch veel op elkaar lijken, wordt voor de analyse van M-FISH vaak een computer gebruikt die de kleurverschillen veel duidelijker kan waarnemen en kwantificeren dan zelfs de best getrainde menselijke ogen.

Centromeerspecifiek

Deze probes hechten aan de centromeer van één specifiek chromosoom. Hiermee kunnen afwijkingen aan de centromeren onderzocht worden.

Locusspecifiek

Deze probes zijn zo ontworpen, dat ze specifiek aan één (kleine) regio van één chromosoom hechten. Deze techniek kan gebruikt worden, wanneer men geïnteresseerd is in deleties, duplicaties of translocaties van een specifieke chromosoomregio, bijvoorbeeld wanneer een patiënt ziekteverschijnselen vertoond die vaak gepaard gaan met een deletie of duplicatie van een bepaald gen of een bepaalde chromosoomregio. De Philadelphiatranslocatie (t9:22) bij chronische myeloïde leukemie (CML) kan bijvoorbeeld aangetoond worden met probes voor specifieke regio's van chromosoom 9 en chromosoom 22.

Cellen in de interfase die positief zijn voor de t(9;22) translocatie

Interfase FISH

Wanneer men geen levende cellen heeft, die gekweekt kunnen worden en tot celdeling gestimuleerd kunnen worden, kan men geen FISH uitvoeren op cellen in de metafase. De interfase FISH kan dan een oplossing zijn. Hierbij worden dezelfde fluorescerende probes gebruikt, die gehybridiseerd worden met het DNA in de celkernen van niet-delende en misschien wel dode cellen. Ook nu zullen de probes hechten aan specifieke gebieden, die dan oplichten als stipjes in de celkern.

FISH in dieren of bacteriën

FISH kan ook worden gebruikt om met behulp van chromosoompainting een vergelijking of onderscheid te maken tussen twee (dier)soorten. De probes worden dan zo ontworpen, dat ze specifiek zijn voor de chromosomen van de ene of van de andere diersoort.

Ook het DNA van bacteriën kan met behulp van FISH oplichten, waarbij men ook weer verschillend gekleurde probes kan maken voor verschillende bacteriën. Hierdoor kan men snel zien, welke soort bacterie waar en hoeveel voorkomt in biofilms. Deze techniek is ook in de medische wetenschap bruikbaar: wanneer een patiënt een infectie heeft met een onbekende bacterie die zich moeilijk laat kweken, kan men FISH gebruiken om zeer kleine hoeveelheden van deze bacterie toch juist te identificeren.

Literatuurverwijzingen

↑ ^a ^b Everdingen, J.J.E. van, Eerenbeemt, A.M.M. van den (2012). Pinkhof Geneeskundig woordenboek (12de druk). Houten: Bohn Stafleu Van Loghum.

Zie de categorie Fluorescence in situ hybridization van Wikimedia Commons voor mediabestanden over dit onderwerp.

[Pinkhof2012-1] Everdingen, J.J.E. van, Eerenbeemt, A.M.M. van den (2012). Pinkhof Geneeskundig woordenboek (12de druk). Houten: Bohn Stafleu Van Loghum.

[1]