Gelelektroforese

Uit Wikipedia, de vrije encyclopedie
Ga naar: navigatie, zoeken
Gelelektroforeseapparaat

Gelelektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool (anode) zich bevindt. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze zullen bewegen (migreren); hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen bewegen.

Deze moleculen kunnen zowel eiwitten als DNA-fragmenten zijn.

De gel kan uit polyacrylamide bestaan (= polyacrylamidegelelektroforese). Ook wordt er vaak een Agarosegel gebruikt. Voor chromosomaal DNA wordt vaak een agarosegel gebruikt van 0,8 tot 1%, voor PCR producten is dit 1 a 2% en voor restrictieproducten 1,5 a 2%.

Praktisch:

  • Na het maken van de gel op basis van poeder en water of TBE(Tris, Boraat, EDTA) buffer, wordt de gel in een reservoir gelegd met een bufferoplossing. Het te scheiden mengsel wordt in de uitsparingen t.h.v. de kathode in de gel geïnjecteerd en de spanning wordt aangelegd. Ideaal laat men de spanning aan totdat de snelste (kleinste) moleculen zich ongeveer volledig door de gel een weg gebaand hebben. Om te weten waar het kleinste fragment zich bevindt, wordt er vaak Orange G toegevoegd. Deze kleurstof is kleiner dan het kleinste DNA fragment, en zal dus als eerst het eind van de gel bereiken. Een andere functie van Orange G is het verzwaren van het te injecteren monster om uitloop te voorkomen
  • Om de moleculen zichtbaar te maken, kan men gebruikmaken van zilverkleuring, Coomassieblauw, SYBR® Green of ethidiumbromide in combinatie met UV-licht. Bij radioactieve moleculen kan men de visualisatie met een fotofilm doen.
  • Door in andere rijen (lanes) gebruik te maken van mengsels waarvan de samenstelling bekend is, kan men de fragmentgrootte bepalen. Bekende mengsels zijn vaak basenparenladders. De fragmenten hierin hebben allemaal een bepaalde lengte, bijvoorbeeld 50bp (basenparen). Dit wordt gedaan om de fragmentgroottes van monsters te bepalen, maar ook om te kijken of er wel daadwerkelijk wat door de gel heeft gelopen.