High-performance liquid chromatography

Kolom in een HPLC-opstelling

High-performance liquid chromatography (HPLC) is een scheidingsmethode; het is vloeistofchromatografie waarbij de eluens onder hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt gepompt.

De druk kan voor normale HPLC oplopen tot zo'n 200 bar. Voor UPLC (Ultra high performance liquid chromatography) kan de druk zelfs zo'n 1000 bar of meer zijn. Door de hoge druk en het goede contact met de stationaire fase wordt een relatief grote snelheid bereikt van de scheiding, en een zeer goede resolutie. Een typische looptijd voor de meting van één monster met HPLC ligt tussen de 5 en 60 minuten.

Principe

Het monster wordt geïnjecteerd met een injector. Deze injector is een soort kraan met een loop eraan, een lus met een nauwkeurig bekend volume (gewoonlijk 5μl-5mL). Met een injectiespuit vult men deze loop, waarna de stand van de kraan wordt gedraaid, zodat het monster in het systeem wordt geïnjecteerd. Hierna gaat het monster mee met de mobiele fase door de kolom. Door de relatief hoge snelheid van de mobiele fase vindt er nauwelijks diffusie plaats van het monster in het oplosmiddel.

De snelheid waarmee de componenten van het monster de kolom passeren kan beïnvloed worden door een modifier die de elutie versneld toe te voegen aan de mobiele fase. Het percentage modifier kan gedurende de hele analyse gelijk blijven (isocratische chromatografie) of gedurende de analyse oplopen (gradiënt).

De toegepaste modifier is afhankelijk van het type chromatografie.

Type chromatografie	Veelgebruikte basiseluensen	Veelgebruikte modifiers
Reversed phase chromatografie	Water, eventueel met bufferzouten en/of andere hulpstoffen	Methanol, acetonitril
Normal phase chromatografie	Hexaan (of vergelijkbare alkanen), methanol, acetonitril	Water, methanol, acetonitril
Ion-Exchange chromatografie	Oplossingen van natriumhydroxide, natriumcarbonaat en andere zouten	Oplossingen van natriumacetaat, natriumwaterstofcarbonaat en andere zouten

Andere factoren die van belang zijn bij de scheiding zijn: samenstelling van het eluens (pH, toevoeging van hulpstoffen), kolomtype, doorstroomsnelheid (flow), lengte van de leidingen.

Scheidingsmethoden

De binnenkant van de kolom, de stationaire fase, is gevuld met een pakking van kleine bolletjes. Deze pakking is meestal van silica, maar andere materialen komen ook voor. De grootte van de bolletjes is afhankelijk van het type kolom, maar diameters tussen 3 μm en 10 μm zijn het meest gebruikelijk. Kleinere deeltjes geven een betere scheiding dan grotere deeltjes, maar ook een hogere druk. De consequentie daarvan is dat er bij een kolom met grote deeltjes meer ruimte is om de flow te variëren. De bolletjes zijn 'bekleed' (chemisch gebonden) met een actieve laag die een interactie aangaat met de mobiele fase en de componenten van het te analyseren monster.

Normal Phase chromatografie

Bij Normal Phase HPLC is de pakking van de kolom polair en de mobiele fase apolair. Daardoor hebben polaire componenten een sterkere interactie met de stationaire fase dan apolaire componenten. Apolaire componenten komen dus sneller van de kolom af dan polaire componenten. Vanwege het hoge verbruik van organische oplosmiddelen wordt Normal Phase HPLC nog maar weinig toegepast, voor de meeste toepassingen bestaat een milieuvriendelijker Reversed Phase alternatief.

Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography (HILIC)

HILIC is een variant op Normal Phase HPLC. Bij NPLC wordt als mobiele fase een apolair oplosmiddel gebruikt. Dit brengt het probleem met zich mee dat sommige stoffen zo hydrofiel zijn dat ze niet meer van de kolom afkomen. Door minder dan 20% water toe te voegen aan het eluens kan er echter voor gezorgd worden dat ook deze stoffen van de kolom afkomen. Door de competitie van het water en de stoffen voor binding aan de kolom, worden alle stoffen uiteindelijk van de kolom verdreven door het water en komen dus in volgorde van toenemende polariteit van de kolom af. Het toevoegen van water kan zowel isocratisch als met een gradiënt gebeuren.

Reversed Phase chromatografie

Bij Reversed Phase HPLC is de polariteit omgekeerd ten opzichte van Normal Phase HPLC; de pakking van de kolom is apolair en de mobiele fase is polair. Het gevolg daarvan is dat de volgorde van elutie van de verschillende componenten ook omgekeerd is ten opzichte van Normal Phase HPLC: polaire componenten komen sneller van de kolom af dan apolaire componenten.

Paired-Ion Chromatography

Deze techniek wordt gebruikt om met een Reversed Phase kolom, sterk polaire stoffen te scheiden. Normaal zouden de stoffen helemaal niet binden aan de stationaire fase van de kolom, omdat die apolair is. Hierdoor vindt er ook geen scheiding plaats, ze komen namelijk allemaal even snel van de kolom af. Wanneer aanpassing van de pH van de mobiele fase niet voldoende is om de polariteit van de stoffen te laten afnemen, kan er een Ion Pairing Reagent worden toegevoegd aan de mobiele fase.

Een Ion Pairing reagent is een stof die bestaat uit een koolstofketen en een functionele groep waarvan de lading tegenovergesteld is aan de analyte die gescheiden moet worden. De analiet en de ion pairing reagent vormen een ‘’ geneutraliseerd’’ ionen paar, dat minder polair is en redelijk stabiel. Doordat dit ionenpaar minder polair is blijft het aan de stationaire fase zitten en hierdoor kan het gescheiden worden.

Hydrophobic-Interaction Chromatography (HIC)

Deze methode is een variant van Reversed Phase HPLC een wordt veelal toegepast bij de scheiding van eiwitten. Voor een goede detectie van de verschillende eiwitten is het noodzakelijk dat deze in een waterige oplossing blijven en niet in aanraking komen met oplosmiddelen of oppervlakken die hen kunnen denatureren. Door een zoutgradiënt aan te leggen met hoge zoutgehalten in het begin, wordt het evenwicht van de eiwitten tussen mobiele fase en stationaire fase richting de stationaire fase gedreven. Door het zoutgehalte vervolgens langzaam te verlagen, komen de eiwitten weer van de kolom af.

Ion-Exchange Chromatography (IEC)

In het voorafgaande hebben we gezien dat scheiding met behulp van een HPLC meestal plaatsvindt op basis van polariteit, waarbij polaire stoffen een grote affiniteit voor elkaar hebben, maar niet voor apolaire stoffen. Bij ion chromatografie op basis van elektrische lading is dit precies andersom. Positieve lading stoot immers positieve lading af en trekt juist negatieve lading aan. De stationaire fasen in IEC worden gekarakteriseerd bij hun sterkte van hun zure of basische groepen en het soort ionen dat ze binden.

Kation uitwisseling wordt gebruikt om positief geladen ionen (kationen) te binden aan een negatief oppervlak en anion uitwisseling om negatief geladen ionen (anionen) te binden aan een positief oppervlak. Om zwakke zuren of basen van elkaar te scheiden wordt gebruikgemaakt van sterke ion exchangers, die hun lading behouden binnen een groot pH bereik. De zwakke zuren of basen worden dus in geïoniseerde vorm op de kolom gebracht, waardoor ze aan de stationaire fase kunnen binden. Vervolgens wordt de pH van de mobiele fase zo aangepast dat stof neutraal wordt. De stationaire fase blijft echter geladen, omdat deze sterke zure of basische groepen heeft. Hierdoor verdwijnt de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase en komt deze stof van de kolom af.

Bij de scheiding van sterke zuren of basen wordt het principe precies omgekeerd en wordt er gebruikgemaakt van een stationaire fase met zwakke zure of basische groepen. Hierdoor wordt de stationaire fase neutraal, wanneer de pH wordt veranderd en verdwijnt wederom de affiniteit tussen de stof en de stationaire fase, waardoor deze van de kolom afkomt.

Chirale chromatografie

Wanneer de structuurformule van de te analyseren stof een asymmetrisch koolstofatoom bevat betekent dit meestal dat de stof aanwezig is in een mengsel van R en S enantiomeren. Dit mengsel is met een normale kolom niet te onderscheiden, omdat ze in gelijke mate binden aan de stationaire fase. De twee stoffen komen dan gelijkertijd van de kolom en geven maar één piek bij de detector. Dit kan wel met een chirale kolom waarin ook de stationaire fase uit enantiomeren bestaat. De scheiding wordt veroorzaakt door de reversibele bindingen van R (analiet) / R (stationaire fase en S (analiet) / S (stationaire fase) waarvan de stabiliteit iets verschilt. Het verschil in stabiliteit van de binding leidt ertoe dat er een scheiding plaatsvindt en dat er uiteindelijk twee pieken ontstaan.

Detectiemethoden

De chromatografie is belangrijk om de compositie van het monster te bepalen, maar om de concentratie van het monster te bepalen is er een bepaalde detector nodig. Er zijn verschillenden detectoren voor HPLC. Zo zijn er onder andere de spectrofotometrie detector, de fluorescentie detector en Refractie-index detector( RI detector).

Spectrofotometrie

Spectrofotometrische detectoren zijn selectieve detectoren, wat inhoudt dat de spectrofotometrische detector selectief stoffen kan detecteren, door het aanpassen van de golflengte waarmee gedetecteerd wordt.

Deze detectiemethode is gebaseerd op de wet van Lambert-Beer (A = ɛ ℓ C). De absorptie A van de mobiele fase wordt aan het einde van de kolom gemeten, bij 1 of meerdere golflengtes. De absorptie is de lichtintensiteit die de mobiele fase in wordt gestuurd minus de lichtintensiteit die er vervolgens weer uit komt. Deze intensiteit is afhankelijk van de molaire absorptie coëfficiënt : ɛ. Het is essentieel dat de mobiele fase bij de relevante golflengte transparant is of een lage concentratie heeft. Indien dit niet het geval is zal de absorptie zodanig groot worden, dat er geen of te weinig licht meer uit het monster komt.

Wanneer de absorptie A, de extinctie coefficiënt ɛ en de lengte van het cuvet ℓ bekend zijn kunnen deze waardes ingevuld worden in de wet van Lambert-Beer. Op deze manier kan de concentratie van het monster berekend worden.

Bij spectofotometrie zijn er twee verschillende detectie mogelijkheden: monochromatische detectie en polychromatische detectie. Monochromatische detectie houdt in, dat er bij een kleine bandbreedte van het spectrum, de absorptie wordt gemeten. Van het licht worden hier de ongewenste golflengte weg gefilterd, waardoor alleen de gewenste golflengtes door het monster gaan. Polychromatische detectoren kunnen tijdens de meting de golflengte veranderen en zo een groot golflengtegebied in korte tijd langs gaan, of meerdere golflengtes simultaan meten, zodat de absorptie van het monster gemeten kan worden bij verschillende golflengtes of een groot gebied van golflengtes op te vangen zonder dat de circulatie in de kolom te onderbreken. De Diode Array Detector (DAD) behoort tot de polychromatische detectors. Deze detector geeft spectrale informatie, waar gescheiden componenten herkend kunnen worden.

Fluorescentiedetector

Schematisch overzicht van een flow cel in een fluorescentie detector

Fluorescentie detectoren worden voornamelijk bij vloeistof chromatografie gebruikt en detecteren alleen fluorescente stoffen. Ongeveer 10 % van de organische samenstellingen zijn fluorescent. Fluorescente stoffen hebben de capaciteit om een deel van het licht dat uitgezonden wordt door de lichtbron te absorberen en gedeeltelijk terug te zenden met een andere golflengte. De intensiteit van fluorescente stoffen zijn evenredig met de concentratie van de analyt, zolang de concentratie van de analyt laag wordt gehouden. De fluorescentie detectoren zijn erg gevoelig en worden daarom vaak gebruikt bij het analyseren van sporen. Jammer genoeg is de reactie slechts lineair over een relatief beperkt concentratiegebied van twee ordes van grootte.

Een flow cel wordt gebruikt als sensor waar het exciterende licht axiaal doorheen gaat. Een fotocel zit gevestigd aan de kant van de cel om het uitgezonden licht op te vangen. De celwand wordt vaak gemaakt van Pyrex glas om te verhinderen dat het exciterende licht ( meestal UV-licht) de fotocel bereikt. Wanneer het fluorescente monster in de cel zit absorbeert deze het exciterende licht en zendt dit in een andere golflengte weer uit. Het geëmitteerde licht de celwand en wordt ontvangen door de fotocel. De intensiteit van het licht wordt door een computer geregistreerd. Het exciterende licht kan bij 254 nm UV door een kwiklamp veroorzaakt worden of het licht kan van een deuteriumlamp zijn dat bij elke golflengte geproduceerd kan worden door een monochromator.

Het meetdomein van de fluorescentie detector, in hoeverre de detector stoffen kan detecteren, kan uitgebreid worden door het gebruik van een derivatiseringstechniek. Deze derivatiseringstechniek houdt in dat stoffen ofwel voordat ze in de kolom gaan of als ze net uit de kolom komen worden gemodificeerd tot afgeleiden (of derivaten), waardoor ze beter zijn te detecteren. Er zijn een aantal reagentia die specifiek ontwikkeld zijn om fluorescente derivaten te synthetiseren. Voor deze methode wordt een automatische reagensautomaat of voorafgaand aan de kolom of tussen de kolom en detector geplaatst. Dit wordt gedaan om het monster 1 of meerdere reacties te laten ondergaan en deze fluorescent te maken voor of nadat het monster is geïnjecteerd.

Brekingsindexdetector

Schematisch overzicht van een RI detector

De Refractie-Index detector (RI detector) is gebaseerd op het principe van de refractie-index (brekingsindex). De detector bestaat schematisch uit twee compartimenten, waarvan één is gevuld met pure mobiele fase en één met de mobiele fase, die van de kolom af elueert. In de praktijk gebeurt het vaak dat de optische eigenschappen van deze media verschillen, en vaak komen deze fases slechts bij één golflengte overeen. Het uitgezonden licht is daarom praktisch altijd monochromatisch. Wanneer er een stof uit de kolom elueert verandert deze stof de optische eigenschappen van de mobiele fase, waardoor ook de refractie-index verandert. Deze verandering van de refractie-index wordt gevisualiseerd in de vorm van een verandering van de hoek van de uitgezonden lichtstraal. Door middel van terugkoppeling kan deze verandering geregistreerd worden en uitgezet. De detector registreert zowel positieve als negatieve pieken, waardoor de nullijn van de grafiek in het midden is uitgezet.

Schematisch overzicht van een flow cel in een RI detector

De RI detector is een van de minst gevoelige LC detectoren. Dit komt doordat het zeer gevoelig is voor veranderingen in temperatuur, druk en flow rate. Als een gevolg hiervan, moet de temperatuur van de detector met uiterste precisie worden gereguleerd (tot het punt van 0,001◦C, evenals de temperatuur in de kolom. Ook is het niet mogelijk om een RI detector te gebruiken bij een HPLC met een gradiënt. In het geval dat de mobiele fase niet isocratisch is zal de mobiele fase uit de kolom steeds meer afwijken van de pure mobiele fase. Hierdoor zal de refractie-index veranderen en de grafiek een piek weergeven, terwijl dit niet komt door een analyt. De RI detector wordt vaak gebruikt in combinatie met andere detectoren. Ondanks deze nadelen wordt de RI detector vaak gebruikt. Dit komt doordat de detector ideaal is voor het detecteren van niet-ionische stoffen, die geen UV-straling absorberen en niet fluoresceren. Stoffen die het beste te detecteren zijn met de RI-detector zijn vetzuren, alcoholen, suikers etc.)

Evaporative Light Scattering Detector

In een ELSD-detector wordt de mobiele fase die van de kolom af komt continu verneveld. Deze nevel wordt beschenen met een lichtbron. De druppeltjes waar de nevel uit bestaat weerkaatsen een deel van het licht, en de intensiteit van dat weerkaatste licht wordt gemeten met een lichtgevoelige cel. Op het moment dat er een component van de kolom af komt verandert de gemiddelde grootte van de druppeltjes, waardoor ook intensiteit van het weerkaatste licht verandert. Deze verandering in intensiteit wordt geregistreerd door de lichtgevoelige cel en resulteert in een piek in het chromatogram.

Het voordeel van een ELSD-detector is dat er een zeer breed scala aan componenten mee gemeten kunnen worden; stoffen die op geen enkele manier optisch actief zijn (en dus niet gedetecteerd kunnen worden met een spectrofotometer, fluorescentiedetector of brekingsindexdetector) kunnen vaak wel gedetecteerd worden met een ELSD-detector. Het nadeel van een ELSD-detector is dat de signaal-ruisverhouding vaak minder gunstig is dan bij de eerder genoemde detectoren.

Kolomeigenschappen

Eigenschap	Invloed op de scheiding
Kolomdiameter	Kolommen met een kleine diameter geven smallere en hogere pieken dan kolommen met een grote diameter. Daardoor is de detectielimiet lager. Kolommen met een kleine diameter zijn geschikt voor monsters waarin de concentratie van de te analyseren stof laag is. Als de concentratie van de te analyseren stof hoog is kan beter een kolom met een grote diameter gebruikt worden omdat anders overbelading van de kolom op kan treden.
Kolomlengte	Een lange kolom geeft een betere scheiding dan een korte kolom. Daarom zijn lange kolommen geschikt voor monsters die veel verschillende componenten bevatten of wanneer er twee componenten met een klein polariteitsverschil gescheiden moeten worden.
Deeltjesgrootte	Een kolom met kleine deeltjes geeft een betere scheiding, maar ook een hogere druk en is dus niet geschikt voor hoge flows. Kolommen met grote deeltjes zijn vooral geschikt wanneer snelheid belangrijker is dan een goede scheiding en voor preparatieve chromatografie.
Pakkingsmateriaal	Een C18 kolom is minder polair dan een C8 kolom en heeft dus meer interactie met apolaire moleculen. C8 en C4 kolommen zijn geschikt voor polaire monsters zoals bijvoorbeeld peptides.

Kwantificering

Hoe hoger de concentratie van de geïnjecteerde verbinding hoe groter het signaal dat door de detector wordt afgegeven. Het signaal heeft de vorm van een piek (in een grafiek) en men gebruikt het gemeten piekoppervlak om concentraties mee te kwantificeren. Door verschillende concentraties van een standaard te injecteren kan een ijklijn geconstrueerd worden. In een ijklijn worden dus de piekoppervlakten uitgezet tegen de bekende bijbehorende concentraties. Als van dezelfde verbinding met een onbekende concentratie het piekoppervlak wordt bepaald, wordt die waarde geïnterpoleerd in de ijklijn en wordt aldus de concentratie bepaald. De gevonden concentraties moeten nog omgerekend worden naar volume- of gewichtseenheden.

Autosampler

Een autosampler is een robot die de monsters injecteert op de HPLC-kolom. Injecties door een autosampler zijn nauwkeuriger en reproduceerbaarder dan handmatige injecties en daarnaast is het met een autosampler mogelijk om meerdere monsters achter elkaar te meten zonder dat menselijke interventie noodzakelijk is. Een autosampler kan geprogrammeerd worden met behulp van de elektronica van de HPLC zelf of met behulp van een chromatografiedatasysteem.